Vaccini contro l’Ebola: cromatografia liquida – spettrometria di massa ad alta risoluzione per la quantificazione di particelle simili ai virus

La recente epidemia di virus Ebola (EBOV) in Africa occidentale, che ha causato più di 10.000 vite nel 2014, ha evidenziato la necessità critica di solide opzioni di trattamento e prevenzione per combattere questo patogeno altamente virulento. Un’area di indagine promettente utilizza particelle simili a virus (VLP) non infettive per imitare i virus selvatici durante la costruzione del vaccino. Questa strategia è la stessa utilizzata per preparare i vaccini contro il papillomavirus umano (HPV).

Gli studi sui vaccini in corso indicano che, quando somministrati con un adiuvante, gli EBOV VLP (eVLP) sono protettivi contro una dose letale di EBOV sia nei topi che nei primati non umani. Tuttavia, i dosaggi del vaccino richiedono una misurazione precisa della concentrazione della subunità GP1 (porzione N-terminale) della glicoproteina dell’involucro EBOV per garantire che ogni lotto di vaccini eVLP soddisfi gli standard di qualità per l’efficacia prima del rilascio. Per migliorare gli attuali metodi di analisi (Western blotting o ELISA a singolo anticorpo), Cazares et al. (2016) si è recentemente rivolto alla cromatografia liquida a scansione completa con diluizione isotopica – spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) per la quantificazione assoluta di GP1 negli eVLP.1.

I ricercatori hanno selezionato due peptidi target e peptidi AQUA Ultimate etichettati isotopicamente (Thermo Scientific) sintetizzati per ciascuno. Il team ha notato i loro sforzi meticolosi per garantire una digestione triptica completa nonostante le scissioni mancate e la comparsa di isoforme GP1 troncate N-terminali nei lotti eVLP, sottolineando l’importanza della selezione dei peptidi. Dopo la digestione trittica e la purificazione in fase inversa, i ricercatori hanno sottoposto diluizioni di digest di analiti eVLP e standard AQUA pesante a LC-HRMS utilizzando un sistema LC ad alte prestazioni UltiMate 3000 e uno spettrometro di massa Orbitrap Elite Hybrid Ion Trap-Orbitrap dotato di elettrospray riscaldato sorgente ionica di ionizzazione (HESI-II) (tutto Thermo Scientific).

Tre repliche hanno prodotto i seguenti dati sulla concentrazione di GP1: 0,57 mg / ml, 0,49 mg / ml e 0,53 mg / ml, con una media di 0,53 mg / ml ± 0,04 mg / ml e un coefficiente di variazione di 7,6. Ciò significa che, in media, ciascuna aliquota di eVLP comprendeva 1,13 µg di GP1, o l’11,3% della concentrazione proteica totale di 10 µg. Gli autori hanno notato che questi dati riflettono la riproducibilità di LC-HRMS per questo scopo. Hanno anche riportato un intervallo lineare per i dati su diluizioni seriali e un’accuratezza quantitativa fino a 1 fmol.

I ricercatori hanno applicato il loro protocollo ottimizzato a cinque lotti eVLP separati (lotti da A a E) attualmente utilizzati per studi interni sulla vaccinazione degli animali. Hanno riportato un intervallo di concentrazione GP1 da 3,3 mg / ml a 7,2 mg / ml per LC-HRMS rispetto a 0,71 mg / ml a 1,4 mg / ml per Western blot. Il team ha indicato che questa differenza probabilmente derivava dalla comparsa di isoforme GP1 troncate N-terminale precedentemente descritte, nonché dalla presenza di GP2 (la porzione C-terminale della glicoproteina dell’involucro).

Infine, il team di ricerca ha immunizzato i topi (n = 20) utilizzando tutti e cinque i lotti di eVLP e ha confrontato i dati di sopravvivenza dopo il test EBOV. Hanno trovato la più bassa incidenza di sopravvivenza (40%) negli animali che ricevevano vaccini di lotto E e la più alta incidenza di sopravvivenza (100%) per quelli che avevano ricevuto vaccini di lotto A o di lotto B. Ciò è significativo, perché il lotto A conteneva la concentrazione di GP1 più alta, come determinato da LC-HRMS, mentre il lotto E conteneva la concentrazione di GP1 più bassa. Utilizzando i dati acquisiti qui, i ricercatori hanno determinato che la concentrazione effettiva di antigenico GP1 era di 2,89 µg per 10 ug di GP1. Hanno segnalato questo come la dose minima di vaccinazione per la sopravvivenza del 100%.

Nel complesso, Cazares et al. evidenziare che il metodo tradizionale (Western blot) sovrastimava la concentrazione di GP1 in eVLP perché non distingueva tra GP1 e proteine ​​correlate (cioè, GP2 o isoforme GP1 troncate). Per questo motivo, solo i dati LC-HRMS erano correlati con i tassi di sopravvivenza dopo il challenge EBOV. I ricercatori indicano che questo saggio migliorato consentirà un monitoraggio più preciso della variabilità dei lotti di eVLP, ottimizzerà la produzione di vaccini e aiuterà a determinare un dosaggio adeguato.

Riferimento
1. Cazares, L.H., et al. (2016) “Sviluppo di un metodo di spettrometria di massa ad alta risoluzione per cromatografia liquida per la quantificazione della glicoproteina dell’involucro virale in preparazioni di vaccini con particelle simili al virus Ebola”, Clinical Proteomics, 13 (1) (18), doi: 10.1186 / s12014-016- 9119-8.

Melissa J. Mayer Thermo Fisher 2016