Soluzioni di monitoraggio della mutazione del gene S nella linea di ceppo B.1.1.7 (501Y.V1) SARS-CoV-2

Questo blog rappresenta le informazioni più aggiornate sulla sorveglianza SARS-CoV-2 al 17 febbraio.

La recente notizia che un lignaggio SARS-CoV-2 altamente trasmissibile originariamente rilevato nel Regno Unito (UK) si è diffuso negli Stati Uniti (USA) serve a ricordare che resta fondamentale continuare a indagare sulla crisi attuale, che caratterizza il virus ceppi ulteriormente e monitorare la diffusione del virus a livello di popolazione al fine di valutare l’efficacia delle strategie di contenimento, compreso un vaccino.

Il nuovo lignaggio SARS-CoV-2 – B.1.1.7 – pone una sfida a questi sforzi. Secondo il Centro europeo per il controllo e la prevenzione delle malattie (eCDC), “sebbene sia noto e prevedibile che i virus cambino costantemente attraverso la mutazione che porta alla comparsa di nuove varianti, un’analisi preliminare nel Regno Unito suggerisce che questa variante è significativamente più trasmissibile rispetto al passato. varianti circolanti ”[1].

Il nuovo lignaggio B.1.1.7 è caratterizzato da 17 mutazioni che causano alterazioni degli aminoacidi, 8 delle quali si verificano nel gene per la proteina spike (S). Il kit combinato Applied Biosystems TaqPath COVID-19, che utilizza un test RT-qPCR per rilevare SARS-CoV-2 in più paesi, contiene un gene target S in una di queste regioni, dove c’è la delezione degli amminoacidi 69 e 70 (69-70del). A causa del design multi-target di questo test, la sensibilità complessiva del test non dovrebbe essere influenzata dalla variante B.1.1.7.

Ulteriori informazioni sull’impatto della mutazione 69-70 del sul test TaqPath COVID-19.

Se un campione con una variante che ha la mutazione 69-70del viene testato utilizzando il test TaqPath COVID-19, si verificherà un “abbandono” del gene S. Per questo motivo, il test può segnalare la presenza della mutazione 69-70del e, potenzialmente, del lignaggio B.1.1.7 (variante 501Y.V1).

La conferma del ceppo variante può essere ottenuta mediante sequenziamento. Sono disponibili più opzioni per il sequenziamento di routine degli isolati della ricerca clinica di SARS-CoV-2.

Le informazioni e i prodotti presentati di seguito sono solo a scopo di ricerca e non per scopi diagnostici. Sequenziamento di Sanger.

Sono stati sviluppati diversi approcci di sequenziamento di Sanger a genoma intero che possono essere utilizzati per il sequenziamento di un singolo campione del virus per identificare le mutazioni e per confermare i dati dal sequenziamento NGS [2,3]. Conferma dell’abbandono del gene S.

Approcci di sequenziamento Sanger più mirati con amplificazione di un breve tratto del gene S nella regione della delezione possono essere utilizzati per verificare l’abbandono del gene S nel test TaqPath COVID-19. Per campioni a bassa carica virale, è possibile utilizzare una fase di preamplificazione per potenziare il segnale di sequenziamento di Sanger. I primer necessari per la pre-amplificazione e la PCR (Tabella 1) possono essere ordinati dalla nostra pagina Web personalizzata per l’ordinazione di oligo. Questi primer possono essere utilizzati per sequenziare la delezione, eseguendo l’amplificazione PCR seguita dal sequenziamento di Sanger utilizzando primer M13 generici con etichetta di sequenza. Quando si ordina tramite la pagina Web di ordinazione oligo personalizzata, è possibile utilizzare un elenco precompilato di Microsoft Excel per un comodo caricamento in blocco. Un protocollo dettagliato per confermare la delezione del gene S mediante sequenziamento di Sanger ** è disponibile ed è stato sviluppato per lavorare con campioni di RNA purificato.

Altre firme di mutazione, altri lignaggi
Sebbene l’abbandono del gene S nel test TaqPath COVID-19 possa segnalare la presenza del lignaggio B.1.1.7, ci sono mutazioni in altre regioni del genoma SARS-CoV-2 che forniscono una firma genomica per questo lignaggio [4]. Un altro lignaggio altamente trasmissibile, designato come B.1.351 (noto anche come variante 501Y.V2), è stato recentemente identificato e, in modo simile a B1.1.7, è stato anche scoperto che ha mutazioni multiple nel gene S [5].

E un recente focolaio di una variante (B.1.1.28) a Manaus, in Brasile, ha dinamiche di infezione che suggeriscono che potrebbe anche essere altamente trasmissibile [6].

Rilevare le mutazioni firma in questi lignaggi altamente trasmissibili (per B.1.1.7 si ritiene che la diffusione sia più rapida del 56% rispetto ad altre varianti) [7] è importante, non solo per confermare che il campione contiene il particolare lignaggio, ma anche per il monitoraggio epidemiologico di come il lignaggio cambia nel tempo [5]. Il sequenziamento di Sanger delle regioni genomiche che trasportano le mutazioni di firma può essere utile per entrambi questi scopi. Abbiamo quindi progettato una serie di primer † e un protocollo di sequenziamento di Sanger ‡ che possono essere utilizzati per rilevare le mutazioni che sono caratteristiche delle linee B.1.1.7 e B.1.351. L’uso del kit di sequenziamento del ciclo diretto BigDye di Applied Biosystems e del kit di purificazione BigDye XTerminator semplifica il processo, fornendo dati di sequenziamento in circa quattro ore. Il pannello è progettato per essere flessibile, consentendo ai ricercatori di scegliere e scegliere le coppie di primer che meglio si adattano alle loro esigenze di ricerca. Infine, ciascuno degli ampliconi è lungo diverse centinaia di basi. Eventuali nuove mutazioni che differiscono da un ceppo di riferimento possono essere identificate mediante sequenziamento di Sanger, fornendo indizi sull’evoluzione del virus nel tempo.

Accedere al protocollo per il sequenziamento di Sanger delle linee di ceppo SARS-CoV-2 B.1.1.7 e B.1.351

Un elenco aggiuntivo di oligo personalizzati relativi alle linee B.1.1.7 e B.1.351 può essere utilizzato anche per gli ordini in blocco nella pagina degli oligo personalizzati

Scopri di più sulle nostre soluzioni di sequenziamento Sanger per la ricerca SARS-CoV-2

Sequenziamento di nuova generazione
Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) può essere utilizzato per l’analisi e il monitoraggio del genoma completo di SARS-CoV-2. Il saggio di ricerca Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 è una soluzione NGS mirata che facilita il sequenziamento completo del genoma virale e il rilevamento delle varianti di SARS-CoV-2. Il design intelligente, con la maggior parte del genoma virale coperto da due ampliconi, fornisce una protezione eccezionale contro le variazioni naturali e garantisce prestazioni robuste anche quando il virus muta rapidamente, rendendolo utilizzabile in un’ampia varietà di applicazioni epidemiologiche per SARS-CoV-2 ricerca. Il test fa parte di un flusso di lavoro NGS mirato veloce, automatizzato e accurato che consente la digitazione del coronavirus in meno di un giorno. Questa soluzione di ricerca end-to-end include la suite di analisi e plug-in sviluppata in collaborazione con i ricercatori in prima linea nella crisi sanitaria della SARS-CoV-2. I nostri sistemi NGS mirati complementari rendono la ricerca epidemiologica SARS-CoV-2 accessibile a qualsiasi laboratorio, indipendentemente dal livello attuale di esperienza NGS del tuo team.

Risorse
* Elenco per Sanger Sequencing Oligos per il dosaggio del gene S SARS-CoV-2 (file Microsoft Excel .xls) Nota: a seconda delle singole impostazioni del browser, “consenti download” o fai clic con il pulsante destro del mouse per aprire il file in una nuova scheda.

** Protocollo dettagliato per l’analisi delle sequenze del gene S SARS-2-CoV mediante sequenziamento di Sanger (.pdf)

† Elenco aggiuntivo di oligo personalizzati relativi alle linee B.1.1.7 e B.1.351 (file Microsoft Excel .xls) Nota: a seconda delle singole impostazioni del browser, “consenti download” o fai clic con il pulsante destro del mouse per aprire il file in una nuova scheda.

‡ Protocollo per il sequenziamento di Sanger delle linee di ceppo SARS-CoV-2 B.1.1.7 e B.1.351 (.pdf) La funzione delle sequenze di primer descritte in questo documento sono in fase di verifica.

Riferimenti
1. https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/threat-assessment-brief-rapid-increase-sars-cov-2-variant-united-kingdom

2. Paden CR, Tao Y, Queen K, Zhang J, Li Y, Uehara A, et al. Sequenziamento rapido, sensibile e completo del genoma della sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 2020; 26 (10): 2401-2405. https://dx.doi.org/10.3201/eid2610.201800

3. http://weekly.chinacdc.cn/en/article/doi/10.46234/ccdcw2020.088

4. Wise J et al. (2020) Covid-19: la nuova variante del coronavirus è stata identificata nel Regno Unito. BMJ 16 dicembre; 371: m4857. doi: 10.1136 / bmj.m4857.

5. Tegally H et al. (2020) Emersione e rapida diffusione di una nuova linea di coronavirus 2 correlata alla sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) con mutazioni multiple in Sud Africa. medRxiv doi: https://doi.org/10.1101/2020.12.21.20248640.

6. Faria, N.R. (2021) Genomic

7. Davies NG, Barnard RC, Jarvis CI et al. (2020) Trasmissibilità e gravità stimate del romanzo SARS-CoV-2 Variant of Concern 202012/01 in Inghilterra. CMMID. Preprint pubblicato online il 23 dicembre 2020. Aggiornato il 31 dicembre 2020. doi: 10.1101 / 2020.12.24.20248822.